As coleções apresentam importantes núcleos de Arte e Arqueologia, reunindo igualmente uma Coleção de História Natural (Ciências da Terra e Ciências da Vida) a ainda objetos científicos (Ciência e Técnica). Do vasto espólio destaca-se a coleção de pintura, que abrange o período temporal do século XV ao XX, destacando-se a predominância de autores portugueses e de pinturas pertencentes às Igrejas e Conventos extintos da cidade. Neste âmbito, merecem destaque os retábulos flamengos do Altar-mor da Sé de Évora e da Capela do Esporão, o Tríptico do Conventinho de Valverde, de Gregório Lopes, bem como os Frei Carlos do Convento do Espinheiro e Francisco Henriques, pintor de São Francisco de Évora. Na coleção de pintura estrangeira, pertencente em grande parte a Frei Manuel do Cenáculo, destacam-se obras da escola Holandesa e Italiana. Na coleção de escultura destacam-se os elementos de arquitetura provenientes de monumentos da cidade e ainda importantes exemplares de tumulária dos séculos XIV ao XVIII, com relevância artística as obras atribuídas a Nicolau Chanterene. A coleção de mobiliário permite traçar um percurso tipológico do mobiliário cível entre os séc. XVI a XIX. A extinção das Ordens Religiosas e a consequente integração dos seus espólios contribuíram para a criação das coleções de Ourivesaria, sobretudo composta por alfaias litúrgicas, joalharia e têxteis, essencialmente paramentaria litúrgica. A coleção de numismática e naturália provem essencialmente da coleção do arcebispo Frei Manuel do Cenáculo. A vasta e representativa coleção de arqueologia é composta por diversas coleções, de que se destaca a de Frei Manuel do Cenáculo. Note-se que o arcebispo foi um dos primeiros a desenvolver trabalhos arqueológicos, dos quais dava conta na sua correspondência. Refira-se ainda a coleção Leonor Pina com o fantástico espólio da Anta Grande do Zambujeiro, juntamente com a chamada coleção do Hospital, com achados referentes a outras antas do Concelho de Évora, Herdade das Casas, Castelo da Lousa, Castelo do Geraldo, peças encontradas em trabalhos de escavações anteriores à obra no edifício do museu, nomeadamente islâmicas e paleocristãs, peças que colmataram algumas falhas da coleção.
